Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng trong nhân giống in vitro cây địa liền (Kaempferia galanga L.)

Cây địa liền hay còn gọi là sơn nại, tam nại, thiền liền, sa khương có tên khoa học là Kaempferia galanga L., thuộc họ gừng Zingiberaceae được sử dụng như một loại thuốc trong y học cổ truyền trong nhiều thế kỷ. Địa liền có vị cay, tính ôn, vào các kinh tâm, tỳ, vị, có tác dụng ôn trung, tán hàn, trừ thấp, tiêu thực, bạt khí độc (Đỗ Huy Bích & cs., 2004). Địa liền phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á và Trung Quốc (Kumar, 2020). Tinh dầu trong thân và rễ cây Địa liền là hợp chất bay hơi, được sử dụng làm gia vị, đồ uống và công nghiệp mỹ phẩm. Nhiều thành phần của cao chiết thân và rễ Địa liền chứa ethyl-p-methoxycinnamate, ethyl cinnamate, 3-carene, camphene, borneol, cineol, kaempferol và kaempferide được báo cáo có các đặc tính sinh học như kháng khuẩn, kháng vi sinh, kháng ung thư, diệt ấu trùng, diệt amip và có các hoạt tính dược lý như giảm căng mạch máu và chống viêm (Shetu & cs., 2018; Yao & cs., 2018; Kumar, 2020). Giá trị của cây Địa liền đã được đông y và y dược hiện đại chứng minh và sử dụng. Chính vì thế, trên thế giới cũng như trong nước, Địa Liền được đánh giá là cây dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao.

Ở nước ta, Địa liền thường mọc tự nhiên và được trồng ở một số tỉnh phía Bắc như Hải Dương, Hưng Yên, Quảng Ninh và ngoại thành Hà Nội. Hiện nay, Địa liền là nguyên liệu ổn định cho các làng nghề thuốc nam như Ninh Hiệp (Hà Nội), Nghĩa Trai (Hưng Yên), Lục Yên (Yên Bái), Mẫu Sơn (Lạng Sơn)... mỗi năm cho thu hoạch hàng nghìn tấn sản phẩm, cung cấp cho ngành dược liệu trong nước và tham gia xuất khẩu. Theo định hướng phát triển cây dược liệu ở nước ta đến năm 2030 của chính phủ, cây Địa liền là một trong 28 cây dược liệu bản địa được chú trọng phát triển ở các vùng quy hoạch trồng cây dược liệu của cả nước (Quyết định 1976/QĐ-TTG, 2013).

Hiện nay, nguồn giống chính của các vùng trồng là củ giống từ vụ trước để lại cho vụ trồng sau. Thực tế này dẫn đến việc tồn trữ và giữ giống hàng năm gặp nhiều khó khăn và rất tốn kém, làm giảm hiệu quả kinh tế. Cho đến nay, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong việc nhân giống cây trồng đã đạt được rất nhiều thành tựu và cho hiệu quả ứng dụng cao. Đây được đánh giá là hướng sản xuất được các cây giống sạch bệnh với số lượng lớn, giúp bảo quản và lưu giữ giống tốt mà ít tốn kém hơn, đồng thời chủ động được nguồn giống phục vụ sản xuất ở quy mô lớn. Trên thế giới, đối tượng cây thuốc Địa liền thu thập ở Ấn Độ, Bangladesh cũng đã được nghiên cứu nhân giống in vitro, tái sinh cây từ lá và thân củ, tạo rễ củ trong ống nghiệm (Shirin & cs., 2000; Chithra & cs., 2005; Rahman & cs., 2005; Parida & cs., 2010). Tuy nhiên, đối với nguồn gen bản địa của Việt Nam chưa có nghiên cứu nào được tiến hành. Từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nhân giống in vitro cây dược liệu Địa liền để phục vụ công tác lưu giữ và nhân giống trong điều kiện in vitro.

Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến hiệu quả nuôi cấy khởi động chồi mầm Địa liền

Chồi mầm Địa liền sau khi làm sạch và khử trùng bằng dung dịch Presept 0,5% và HgCl₂ 0,1% với 3 công thức khác nhau về thời gian được cấy trên môi trường nuôi cấy khởi động trong 4 tuần. Kết quả thể hiện trong bảng 1 cho thấy, chất khử trùng Presept (0,5%) sử dụng để làm sạch bề mặt chồi mầm Địa liền trong khoảng thời gian 5-10 phút là không đủ tác động để diệt hết tế bào nấm khuẩn; tất cả mẫu đều bị nhiễm nấm và vi khuẩn sau 3-7 ngày vào mẫu. Như vậy, chất khử trùng Presept với nồng độ và thời gian đã khảo sát không phù hợp để sử dụng cho việc khử trùng bề mặt chồi mầm Địa liền. Đối với chất khử trùng là dung dịch HgCl₂ 0,1%, khi khử trùng trong thời gian 5 phút cho tỉ lệ mẫu sạch tương đối cao (78%) và có 72% mẫu có khả năng tái sinh. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 8 và 10 phút, tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ mẫu tái sinh cũng tăng theo. Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút, tỉ lệ mẫu sạch tăng lên 96%, trong đó 92% mẫu có khả năng tái sinh. Như vậy với chồi mầm Địa liền có thể sử dụng chất khử trùng HgCl₂ 0,1% trong thời gian 10 phút là phù hợp để tạo mẫu sạch cho quá trình nuôi cấy in vitro.

 Bảng 1. Tác động của chất khử trùng và thời gian khử trùng
đến hiệu quả nuôi cấy khởi động chồi mầm Địa liền (theo dõi sau 4 tuần)

Ghi chú: Môi trường nền: MS + 1 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l agar (pH = 5,8).

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến khả năng nhân nhanh in vitro chồi cây Địa liền

Kết quả ở bảng 2 cho thấy khi bổ sung BA và Kinetin vào môi trường nuôi cấy đã kích thích mẫu cấy phát triển chồi, gia tăng hệ số nhân chồi và chiều cao chồi của mẫu cấy. Đối với các công thức môi trường có bổ sung BA, hệ số nhân chồi tăng từ 2,33-3,63 chồi/mẫu cấy. Đối với nhóm công thức môi trường có bổ sung Kinetin, hệ số nhân chồi có sự khác biệt so với đối chứng và dao động trong khoảng 2,03 chồi/mẫu cấy đến 3,11 chồi/mẫu cấy. Khi so sánh hiệu quả kích thích mẫu cấy tạo chồi của BA và Kinetin có thể thấy rằng BA có tác động tốt hơn trong các nồng độ khảo sát. Như vậy, môi trường nuôi cấy cơ bản MS có bổ sung 2 mg/l BA là môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi Địa liền, với hệ số nhân là 3,63 chồi/mẫu cấy. Đây là công thức môi trường có giá trị khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy P <0,05 so với các công thức môi trường khác. Đối với chỉ tiêu chiều cao chồi, tất cả các công thức môi trường có bổ sung cytokinin đều thu được chồi có chiều cao lớn hơn công thức đối chứng nhưng không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các công thức này.

Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, chồi Địa liền ở tất cả các công thức có hoặc không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đều phát sinh rễ (Hình 1). Hiện tượng này cũng được ghi nhận ở các nghiên cứu khác trên đối tượng cây Địa liền thu thập ở các vùng sinh thái khác như Ấn Độ (Shirin & cs., 2000; Chithra & cs., 2005; Parida & cs., 2010). Sự hình thành rễ trong quá trình nhân chồi cây Địa liền đã làm thay đổi quy trình nhân giống của đối tượng này khi không cần giai đoạn nuôi cấy bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin để tạo cây hoàn chỉnh.

Bảng 2. Ảnh hưởng của BA và Kinetin đến khả năng nhân nhanh in vitro chồi cây Địa liền (sau 4 tuần nuôi cấy)

Ghi chú: Các chữ cái khác nhau ở các số liệu trong cùng một cột thì sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P <0,05;
* : chồi in vitro phát triển rễ.

Ảnh hưởng của BA và a-NAA hoặc IAA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Địa liền

Kế thừa kết quả nghiên cứu từ thí nghiệm 2, hai nồng độ BA thích hợp được lựa chọn để nghiên cứu kết hợp với các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin là 2 mg/l và 3 mg/l. Trên nền môi trường có chứa BA, các chất a-NAA (0,1; 0,5 mg/l) và IAA (0,1; 0,5 mg/l) lần lượt được bổ sung. Số liệu ở bảng 3 cho thấy, sự kết hợp BA và -NAA (0,1; 0,5 mg/l) trong môi trường nuôi cấy có tác dụng làm tăng hệ số nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi in vitro. Ở tất cả các công thức kết hợp giữa BA và -NAA đều cho hệ số nhân chồi và chiều cao chồi cao hơn các công thức đối chứng. Môi trường có 2 mg/l BA kết hợp 0,5 mg/l -NAA cho hệ số nhân chồi và chiều cao chồi tốt nhất; đạt 5,03 ± 0,10 chồi/mẫu cấy và chồi có chiều cao trung bình 6,22 ± 0,17 cm. Chỉ tiêu hệ số nhân chồi của công thức môi trường này là có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P <0,05. Đặc trưng hình thái của mẫu cấy trên môi trường này là bên cạnh hệ số nhân cao thì thân lá và rễ của chồi in vitro cũng phát triển mạnh. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy lên 5 tuần, chồi in vitro có rễ dài, lá phát triển to và mở, phát triển hình thái hoàn chỉnh (Hình 2). Khi tăng nồng độ BA lên 3 mg/l kết hợp cùng -NAA thì cũng giúp gia tăng hệ số nhân chồi so với đối chứng, tuy nhiên các giá trị này lại nhỏ hơn công thức tối ưu. Ngược lại với sự kết hợp giữa BA và NAA, khi kết hợp BA và IAA lại không làm thay đổi hệ số nhân chồi. Tất cả các công thức kết hợp BA và IAA đều cho hệ số nhân chồi không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với công thức đối chứng. Kết quả của nghiên cứu này khác với kết quả thu được của Senarath & cs. (2017) trên nguồn gen cây Địa liền thu thập ở Philippines khi kết hợp BA và IAA cho hệ số nhân chồi tối ưu đạt 12 chồi/mẫu cấy. Như vậy ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đối với các kiểu gen cây Địa liền khác nhau là khác nhau. Đối với nguồn vật liệu Địa liền thu thập ở miền bắc Việt Nam, môi trường kết hợp BA 2 mg/l và -NAA 0,5 mg/l là môi trường tối ưu để nhân nhanh trong điều kiện in vitro.

Bảng 3. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Địa liền in vitro
(sau 4 tuần nuôi cấy)

Ghi chú: Các chữ cái khác nhau ở các số liệu trong cùng một cột thì sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P <0,05.

Hình 2: Hình thái chồi và rễ của cây Địa liền in vitro trên môi trường MS kết hợp 2 mg/l BA và 0,5 mg/l a-NAA (sau 5 tuần nuôi cấy)

Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển đến hệ số nhân chồi in vitro trên môi trường tối ưu

Trong nhân giống in vitro, mẫu cấy qua một số chu kỳ nhân giống (lần cấy chuyển nhân nhanh) sẽ bắt đầu xuất hiện các hiện tượng thoái hóa như giảm hệ số nhân, cây bị bạch tạng, thân lá không phát triển bình thường. Trong thí nghiệm này, chúng tôi nghiên cứu phản ứng của chồi Địa liền in vitro khi được nuôi cấy liên tục trên môi trường có chứa chất điều tiết sinh trưởng. Thí nghiệm được bố trí nuôi cấy trên môi trường MS + 30 g/l sucrose + 2 mg/l BA + 0,5 mg/l -NAA+ 6,5 g/l agar (pH =  5,8) và được cấy chuyển 5 lần liên tiếp. Kết quả thí nghiệm được tổng hợp và trình bày trong bảng 4.

Số liệu ở bảng 4 cho thấy, sau 5 lần cấy chuyển hệ số nhân chồi của chồi Địa liền in vitro không bị giảm sút. Hệ số nhân chồi của các công thức không có sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với P >0,05. Bên cạnh đó hình thái chồi về chiều cao và sự phát triển thân lá cũng được duy trì mà không có sự biến đổi lớn (Bảng 4, hình 3). Sau 5 tháng nuôi cấy trên môi trường có chứa chất điều hòa sinh trưởng, chồi Địa kiền in vitro có lá xanh đậm, hình thái thân, lá và rễ không xuất hiện các đột biến. Thông qua kết quả thí nghiệm này có thể thấy rằng, trên nền môi trường tối ưu (MS + 30 g/l sucrose + 2 mg/l BA + 0,5 mg/l -NAA+ 6,5 g/l agar (pH = 5,8)) hệ số nhân chồi dao động trong ngưỡng 4,8-5,2 chồi/mẫu cấy. Như vậy, từ một mẫu cấy ban đầu, sau 5 tháng nhân nhanh có thể thu được 2500-3800 chồi in vitro. Ưu điểm của môi trường nhân giống này là chồi in vitro đã có đủ thân lá rễ khỏe mạnh nên có thể đưa sang giai đoạn vườn ươm mà không tốn thời gian nuôi cấy tạo rễ.

Bảng 4. Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi in vitro qua các lần cấy chuyển liên tiếp

Ghi chú:Môi trường nền: MS + 2 mg/l BA + 0,5 mg/l a-NAA + 30 g/l sucrose (pH = 5,8); thời gian nuôi cấy cho mỗi lần cấy chuyển là 4 tuần.

Hình 3. Hình thái chồi Địa liền in vitro ở lần cấy chuyển thứ nhất (A) và lần cấy chuyển thứ 5 (B) (sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường mới)

Kết luận

Nghiên cứu đã xác định được phương pháp khử trùng bề mặt thích hợp với chồi mầm từ thân củ cây Địa liền thu thập ở Quảng Ninh là sử dụng dung dịch thủy ngân clorua HgCl₂ 0,1% trong 10 phút. Môi trường tối ưu cho nhân nhanh chồi Địa liền in vitro là môi trường MS có bổ sung BA 2 mg/l, a-NAA 0,5 mg/l và sucrose 30 g/l với hệ số nhân chồi đạt 5,03 chồi/mẫu cấy. Chồi in vitro cây Địa liền vẫn giữ nguyên hệ số nhân chồi và hình thái không bị biến đổi sau 5 lần cấy chuyển liên tiếp trên môi trường nhân nhanh tối ưu. Kết quả của nghiên cứu đã xác định được một đường hướng nhân nhanh Địa liền trong điều kiện in vitro đơn giản, bỏ qua được giai đoạn tạo rễ cho chồi in vitro. Các kết quả nghiên cứu này có thể được áp dụng trong công tác nhân giống, bảo tồn nguồn gen cây thuốc Địa liền thu thập ở Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Chithra M., Martin K. P., Sunandakumari C. & Madhusoodanan P. V. (2005). Protocol for rapid propagation, and to overcome delayed rhizome formation in field established in vitro derived plantlets of Kaempferia galanga L. Scientia Horticulturae. 104(1): 113-120.

Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Mãn P. K. & Nhu Đ. T. (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (1). Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội 782-785.

Kumar A. (2020). Phytochemistry, pharmacological activities and uses of traditional medicinal plant Kaempferia galanga L. – An overview. Journal of Ethnopharmacology. 253: 112667.

Murashige T. & Skoog F. (1962). A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 15(3): 473-497.

Parida R., Mohanty S., Kuanar D. & Nayak S. (2010). Rapid multiplication and in vitro production of leaf biomass in Kaempferia galanga through tissue culture. Electronic Journal of Biotechnology. 13.

Rahman M.M., Amin M.N., Ahamed T., Ahmad S., Habib A., Ahmed R., Ahmed M.B. & Ali M.R. (2005). In vitro rapid propagation of black thorn (Kaempferia galanga L.): A rare medicinal and aromatic plant of Bangladesh. Journal of Biological Sciences. 5: 300-304.

Shetu H., Trisha K., Sikta S., Anwar R., Rashed S. S., Rashed B. & Dash P. (2018). Pharmacological importance of Kaempferia galanga (Zingiberaceae): A mini review. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3: 32-39.

Shirin F., Kumar S. & Mishra Y. (2000). In vitro plantlet production system for Kaempferia galanga, a rare Indian medicinal herb. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 63(3): 193-197.

Yao F., Huang Y., Wang Y. & He X. (2018). Anti-inflammatory diarylheptanoids and phenolics from the rhizomes of kencur (Kaempferia galanga L.). Industrial Crops and Products. 125: 454-461

Thông tin được trích dẫn từ bài báo: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng trong nhân giống in vitro cây Địa liền  (Kaempferia galanga L.). Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2021, 19(8): 1084-1090

Khoa Công nghệ Sinh học