Ngành thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng đóng vai trò vô cùng quan trọng đối với đời sống và nền kinh tế. Hàng năm, ngành tôm Việt Nam đóng góp khoảng 40- 45% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản. Theo báo cáo của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản, năm 2022 Việt Nam xuất khẩu 745 nghìn tấn tôm đạt 4,3 tỷ USD và là nước cung cấp tôm đứng thứ hai thế giới. Tuy nhiên ngành công nghiệp nuôi tôm của nước ta và nhiều nước trên thế giới đã bị thiệt hại rất nghiêm trọng trong những năm gần đây do dịch bệnh ngày càng tăng, một trong số đó là bệnh hoại tử gan tụy cấp.
Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosis disease - AHPND) là một trong những bệnh phổ biến, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi tôm trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Tác nhân gây bệnh được xác nhận do Vibrio parahaemolyticus mang plasmid chứa gen độc tố PirA và PirB (Photorhabdus insect-related (Pir)), gây bệnh cho các loài tôm biển (Tran & cs., 2013; C.F. Lo, & cs., 2014; World Organisation for Animal Health [OIE], 2019). Điểm đáng lưu ý, hai gen độc tố được xác định nằm trên plasmid, có khả năng truyền cho các loại vi khuẩn khác như Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus và vẫn duy trì độc lực gây chết tôm (Lee & cs., 2015; Kondo & cs., 2015). Các chủng vi khuẩn này tồn tại tự nhiên trong môi trường nước lợ mặn nên gây khó khăn trong việc phòng ngừa bệnh, dẫn đến việc sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho tôm nuôi là rất phổ biến.
Berberine có nhiều tác dụng như kháng khuẩn, kháng virus, chống tiêu chảy và chống viêm. Tuy nhiên, berberine hòa tan trong nước kém, hấp thụ nhẹ và sinh khả dụng thấp đã cản trở các ứng dụng của nó. Để khắc phục những hạn chế này, công nghệ nano được coi là giải pháp hữu hiệu. Vật liệu nano đã được biết đến với nhiều các đặc tính ưu việt như tỉ lệ hấp thụ cao, khả năng kháng khuẩn cao, không làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và vật nuôi, thân thiện với môi trường. Vì vậy, nano berberine được hướng đến là chế phẩm an toàn, hiệu quả và thân thiện với môi trường để phục vụ nghề nuôi trồng thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng.
Nghiên cứu này trình bày kết quả ứng dụng nano berberine để thay thế kháng sinh phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm nhằm góp phần phát triển nền nuôi trồng thủy sản theo hướng bền vững.
Kết quả điều chế nano berberine
Kết quả thu được nano berberine có các đặc tính cơ bản như ở bảng 1.
Bảng 1. Đặc tính của nano berberine
|
Đặc tính
|
Đơn vị
|
Giá trị
|
|
Dạng tồn tại
|
|
Dung dịch màu vàng
|
|
Tỷ trọng
|
g/ml
|
≥1,0
|
|
Kích thước tiểu phân
|
nm
|
10-15
|
|
Hàm lượng berberin
|
% (g/100g)
|
6,96
|
Khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của nano berberine bằng phương pháp đục lỗ thạch.
Bảng 2. Kết quả đo vòng kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch.
|
Công thức
|
Nồng độ
|
Kích thước vòng kháng khuẩn (mm)*
|
|
24 giờ
|
36 giờ
|
48 giờ
|
|
ĐC (-)
|
0
|
0f
|
0f
|
0f
|
|
CT1
|
12,5 ppm
|
5,21 ± 0,05e
|
5,32 ± 0,05e
|
5,22 ± 0,03e
|
|
CT2
|
15,0 ppm
|
7,36 ± 0,04d
|
7,57 ± 0,03d
|
7,36 ± 0,02d
|
|
CT3
|
17,5 ppm
|
8,24 ± 0,01c
|
8,32 ± 0,02c
|
8,27 ± 0,00c
|
|
CT4
|
20,0 ppm
|
10,30 ± 0,02b
|
10,37 ± 0,02b
|
10,30 ± 0,03b
|
|
ĐC (+)
|
10,0 ppm
|
14,33 ± 0,03a
|
14,42 ± 0,01a
|
13,53 ± 0,02a
|
|
LSD 0,05
|
0,59
|
0,55
|
0,35
|
*Số liệu được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm
Ghi chú: Giá trị trung bình trong cùng một cột mang chữ cái khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α= 0,05.
Từ kết quả được trình bày ở bảng 2 bước đầu chúng tôi rút ra nhận xét: Nano berberine sử dụng trong thí nghiệm có khả năng ức chế cao đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp. Khả năng ức chế của nano berberine phụ thuộc vào nồng độ, nồng độ nano berberine càng cao khả năng ức chế vi khuẩn càng hiệu quả, thể hiện ở vòng kháng khuẩn càng lớn. Vòng kháng khuẩn của công thức sử dụng kháng sinh lớn hơn so với nano berberine, nguyên nhân có thể là do khả năng khuếch tán của nano berberine trong môi trường thạch kém hơn so với kháng sinh. Tuy nhiên vòng kháng khuẩn của nano berberine ổn định hơn so với kháng sinh theo thời gian.
Khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của nano berberine bằng phương pháp cấy trộn trực tiếp.
Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3, bảng 4, bảng 5; hình 2, hình 3 và hình 4.
Bảng 3. Hiệu lực ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus khi xử lý bằng
nano berberine trong 45 phút.
|
Công thức
|
Nồng độ
|
Số lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy*
|
Hiệu lực
ức chế (%)
|
|
Lần 1
|
Lần 2
|
Lần 3
|
Trung bình
|
|
ĐC (-)
|
0
|
97
|
93
|
96
|
95,33 ± 2,08a
|
0
|
|
CT1
|
2,0 ppm
|
30
|
29
|
28
|
29,00 ± 1,00b
|
69,58
|
|
CT2
|
4,0 ppm
|
15
|
16
|
15
|
15,33 ± 0,58c
|
83,92
|
|
CT3
|
6,0 ppm
|
8
|
8
|
7
|
8,67 ± 0,58d
|
90,91
|
|
CT4
|
8,0 ppm
|
2
|
2
|
2
|
2,00 ± 0,00e
|
97,90
|
|
ĐC (+)
(Streptomycin)
|
10,0 ppm
|
0
|
0
|
0
|
0e
|
100
|
|
LSD 0,05
|
1,83
|
|
*Số liệu được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm
Ghi chú: Giá trị trung bình trong cùng một cột mang chữ cái khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.
    |
 |
| Hình 2. Khuẩn lạc vi khuẩn V. Parahaemolyticus tiếp xúc với nano berberine trong 45 phút sau 24 giờ nuôi cấy |
Bảng 4. Hiệu lực ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus khi xử lý bằng
nano berberine trong 60 phút.
|
Công thức
|
Nồng độ
|
Số lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy*
|
Hiệu lực
ức chế (%)
|
|
Lần 1
|
Lần 2
|
Lần 3
|
Trung bình
|
|
ĐC (-)
|
0
|
107
|
114
|
98
|
106,33 ± 8,02a
|
0
|
|
CT1
|
2,0 ppm
|
21
|
22
|
21
|
21,33 ± 0,58b
|
79,94
|
|
CT2
|
4,0 ppm
|
6
|
6
|
5
|
6,67 ± 0,58bc
|
93,73
|
|
CT3
|
6,0 ppm
|
3
|
4
|
3
|
3,33 ± 0,58c
|
96,87
|
|
CT4
|
8,0 ppm
|
0
|
0
|
0
|
0c
|
100
|
|
ĐC (+)
(Streptomycin)
|
10,0 ppm
|
0
|
0
|
0
|
0c
|
100
|
|
LSD 0,05
|
5,77
|
|
*Số liệu được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm
Ghi chú: Giá trị trung bình trong cùng một cột mang chữ cái khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.
|
 |
| Hình 3. Khuẩn lạc vi khuẩn V. parahaemolyticus tiếp xúc với nano berberine trong 60 phút sau 24 giờ nuôi cấy |
Bảng 5. Hiệu lực ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus khi xử lý bằng
nano berberine trong 75 phút.
|
Công thức
|
Nồng độ
|
Số lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy*
|
Hiệu lực
ức chế (%)
|
|
Lần 1
|
Lần 2
|
Lần 3
|
Trung bình
|
|
ĐC (-)
|
0
|
116
|
113
|
97
|
108,67 ± 8,02a
|
0
|
|
CT1
|
2,0 ppm
|
14
|
13
|
11
|
12,67 ± 1,53b
|
88,34
|
|
CT2
|
4,0 ppm
|
5
|
5
|
6
|
5,33 ± 0,58bc
|
95,10
|
|
CT3
|
6,0 ppm
|
1
|
1
|
1
|
1,00 ± 0,00c
|
99,08
|
|
CT4
|
8,0 ppm
|
0
|
0
|
0
|
0c
|
100
|
|
ĐC (+)
(Streptomycin)
|
10,0 ppm
|
0
|
0
|
0
|
0c
|
100
|
|
LSD 0,05
|
7,56
|
|
*Số liệu được tính trung bình của 3 lần thí nghiệm
Ghi chú: Giá trị trung bình trong cùng một cột mang chữ cái khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.
|
 |
| Hình 4. Khuẩn lạc vi khuẩn V. parahaemolyticus tiếp xúc với nano berberine trong 75 phút sau 24 giờ nuôi cấy |
Ghi chú: CT1- Nano BBr 2,0 ppm, CT2- Nano BBr 4,0 ppm, CT3- Nano BBr 6,0 ppm, CT4- Nano BBr 8,0 ppm, ĐC (+) kháng sinh Streptomycin, ĐC (-) nước cất.
Từ các kết quả trên, có thể thấy nano berberine có tác dụng mạnh với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm. Tất cả các nồng độ nano berberine đều có khả năng ức chế vi khuẩn này. Nhưng khả năng ức chế của nano berberine không chỉ phụ thuộc vào nồng độ mà còn phụ thuộc vào thời gian xử lý, cụ thể như sau:
Ở công thức nano berberine 2,0 ppm, với thời gian tiếp xúc 45 phút hiệu lực ức chế vi khuẩn đạt 69,58%, thời gian tiếp xúc 60 phút hiệu lực ức chế tăng lên đến 79,94% còn với thời gian tiếp xúc 75 phút hiệu lực ức chế đạt 88,34%.
Ở công thức nano berberine 4,0 ppm, với thời gian tiếp xúc 45 phút hiệu lực ức chế vi khuẩn đạt 83,92%, thời gian tiếp xúc 60 phút hiệu lực ức chế tăng lên đến 93,73% còn với thời gian tiếp xúc 75 phút hiệu lực ức chế vi khuẩn đạt 95,10%.
Ở công thức nano berberine 6,0 ppm, với thời gian tiếp xúc 45 phút hiệu lực ức chế vi khuẩn đạt 90,91%, thời gian tiếp xúc 60 phút hiệu lực ức chế tăng lên đến 96,87% còn với thời gian tiếp xúc 75 phút hiệu lực ức chế vi khuẩn đạt 99,08%.
Ở công thức nano berberine 8,0 ppm, với thời gian tiếp xúc 45 phút hiệu lực ức chế vi khuẩn đạt 97,90%, thời gian tiếp xúc 60 phút và 75 phút cho hiệu suất đạt 100%.
Từ kết quả số lượng khuẩn lạc và kết quả tính hiệu lực ức chế vi khuẩn, chúng tôi sơ bộ nhận xét, nano bernerine có khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm, hiệu lực ức chế không chỉ phụ thuộc vào nồng độ nano mà còn phụ thuộc vào thời gian xử lý. Với thời gian xử lý 60 phút, nồng độ nano berberine 8,0 ppm cho hiệu lực ức chế hoàn toàn vi khuẩn, tương đương với hiệu lực ức chế của kháng sinh streptomycin 10ppm, với thời gian 75 phút, nồng độ nano berberine 6,0 ppm cho hiệu lực ức chế gần đạt 100%.
Kết luận
Nano berberine được điều chế bằng phương pháp hoá khử với kích thước hạt trung bình 10-15nm có khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm. Ở thí nghiệm cấy trộn tực tiếp, nồng độ nano berberine có khả năng ức chế hoàn toàn vi khuẩn V. parahaemolyticus là 8,0 ppm với thời tiếp xúc là 45 phút và 6 ppm với thời gian tiếp xúc là 60 phút và 75 phút.
Nhóm NCM Công nghệ sinh học nano và Công nghệ gen-protein tái tổ hợp