Đánh giá đa dạng di truyền 12 mẫu giống đông trùng hạ thảo thu thập ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD và ISSR

Đông trùng hạ thảo (Cordyceps spp.) thuộc chi Cordyceps là loài nấm dược liệu quý và được sử dụng trong y học từ lâu đời. Các phân tích hóa học cho thấy đông trùng hạ thảo (ĐTHT) có chứa nhiều hoạt chất quý như cordycepin, nhiều loại amino acid không thay thế, các chất vi lượng và các loại vitamin (Holliday & cs., 2004; Russell & Paterson, 2008). Chi Cordyceps ghi nhận có khoảng 680 loài phân bố khắp nơi trên thế giới, đặc biệt ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Đông Á và Đông Nam Á, trong đó Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris là hai loài được chú trọng nghiên cứu nhiều nhất (Holliday & cs., 2004; Li & cs., 2006; Russell & Paterson, 2008; Holliday & Cleaver, 2008). Loài C. militaris dễ dàng nuôi cấy nhân tạo và chứa hàm lượng hoạt chất cordycepin cao trong sợi nấm và quả thể (Jędrejko & cs., 2021). Trong khi đó việc nuôi cấy chủ động loài nấm C. sinensis vẫn chưa thực sự thành công (Li & cs., 2006; Stone, 2008; Dong & cs., 2012). Các loài nấm ĐTHT khác nhau có thể dẫn tới sự khác biệt về hàm lượng hoạt chất có hoạt tính sinh học (Wu & cs., 2016). Chính vì vậy, việc xác định chính xác loài cũng như đánh giá được mối quan hệ di truyền nguồn gen của nấm ĐTHT tại Việt Nam là cần thiết, góp phần định hướng cho công tác bảo tồn, quản lý, khai thác và phát triển loài dược liệu quý này một cách phù hợp.

Nấm ĐTHT được phân biệt chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, giải phẫu, sự phát triển của hệ sợi và quả thể. Tuy nhiên, phương pháp này gặp nhiều trở ngại vì hình thái của chúng thay đổi theo điều kiện môi trường và hình thức sinh sản: sinh sản hữu tính (trạng thái quả thể) và sinh sản vô tính (trạng thái sợi nấm). Do đó, việc sử dụng chỉ thị phân tử là cần thiết để xác định loài cũng như đánh giá được mối quan hệ di truyền của nguồn gen ĐTHT.  Trong số đó, kỹ thuật phân tích sử dụng chỉ thị RAPD và ISSR được coi là hiệu quả trong việc đánh giá mối quan hệ di truyền trên nhiều đối tượng khác nhau. Trong nghiên cứu này, 12 mẫu giống ĐTHT thu thập ở các địa điểm khác nhau được định danh bằng giải trình tự vùng ITS và đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen bởi chỉ thị RAPD và ISSR.

Kết quả xác định loài đông trùng hạ thảo bằng phân tích trình tự ITS

Vùng ITS với kích thước khoảng 550 bp của 12 mẫu giống ĐTHT được nhân bản và giải trình tự với cặp mồi ITS4R/ITS5F. Phân tích dữ liệu giải trình tự ITS cho thấy kích thước các đoạn dao động từ 495- 552 nucleotide. Dựa vào kết quả so sánh và tìm kiếm các trình tự ITS tương đồng trong cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST cho thấy tất cả 12 mẫu giống đều thuộc loài Cordyceps militaris (Bảng 1) và có mức độ tương đồng cao đạt 100% với các loài với mã tham chiếu KM197165.1 Cordyceps militaris isolate WU-CMH; JX488481.1 Cordyceps militaris strain 1812; KR673509.1 Cordyceps militaris voucher KA12-1262; MN622777.1 Cordyceps militaris JFRL20 và MK131341.1 Cordyceps militaris voucher Fbozok00139.

Bảng 1. Tỉ lệ thành phần các nucleotide trong vùng giải trình tự của 12 mẫu giống đông trùng hạ thảo

Kết quả phân tích đa dạng di truyền 12 mẫu giống ĐTHT với chỉ thị RAPD và ISSR

Mối quan hệ di truyền của các mẫu giống ĐTHT được phân tích bởi chỉ thị RAPD, ISSR riêng lẻ và kết hợp RAPD + ISSR thông qua hệ số tương đồng di truyền. Hệ số này càng cao chứng tỏ các mẫu có mối quan hệ di truyền càng gần. Khi phân tích bởi RAPD, hệ số tương đồng di truyền giữa 12 mẫu dao động trong khoảng 0,575 - 0,883 trong khi đối với chỉ thị ISSR hệ số này dao động từ 0,559 – 0,863. Như vậy, kết quả phân tích hệ số tương đồng di truyền của 12 mẫu giống bởi hai chỉ thị RAPD và ISSR là có sự khác biệt. Hơn nữa, khi kết hợp hai chỉ thị RAPD và ISSR, hệ số tương đồng di truyền ghi nhận được từ 0,568– 0,841 (Bảng 2).

Bảng 2: Hệ số tương đồng di truyền của 12 mẫu giống Đông trùng hạ thảo bằng chỉ thị RAPD (phía dưới đường chéo) và ISSR (phía trên đường chéo)

Kết quả này cho thấy 12 mẫu giống ĐTHT thu thập có sự đa dạng cao về mặt di truyền. Kết quả tương tự cũng được ghi nhận khi phân tích sự đa dạng di truyền của loài nấm C.sisnesis thu được ở các địa điểm khác nhau ở Trung Quốc sử dụng chỉ thị phân tử RAPD (Chen & cs., 1999) và ITS (Chen & cs., 2004). Ngược lại, Sung & cs. (1999) khi phân tích mối quan hệ di truyền của 72 mẫu giống C. militaris thu ở 11 địa điểm khác nhau tại Hàn Quốc bằng chỉ thị RAPD đã chỉ ra không có mối tương quan giữa sự đa dạng di truyền và nguồn gốc địa lý thu thập các mẫu (Sung & cs., 2004). Tương tự, Wang & cs., 2008 phân tích trình tự ITS chỉ ra khoảng cách di truyền giữa các mẫu C. militaris thu thập ở Anh, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Na Uy là rất nhỏ (<0.01), không tương quan với nguồn gốc địa lý cũng như kiểu dạng của chúng, gợi ý rằng C. militaris phân bố trên toàn thế giới được xem là quần thể đồng nhất (Wang & cs., 2008).

Từ bảng hệ số tương đồng di truyền, sơ đồ mối quan hệ di truyền của 12 mẫu giống được xây dựng bằng phương pháp UPGMA (Hình 1).

Hình 1. Sơ đồ thể hiện mối quan hệ di truyền của 12 mẫu giống đông trùng hạ thảo xây dựng bằng phương pháp UPGMA được phân tích bởi các chỉ thị phân tử (A) chỉ thị RAPD; (B) chỉ thị  ISSR; (C) kết hợp chỉ thị RAPD và ISSR

Kết quả phân nhóm dựa trên chỉ thị RAPD cho thấy: ở mức tương đồng di truyền trung bình 0,71 (71%) 12 mẫu giống đông trùng hạ thảo được phân thành 3 nhóm di truyền chính. Nhóm I gồm 6 mẫu giống, nhóm II gồm 4 mẫu giống Co-HQV, Co-LC, Co-DN và Co-LB và nhóm III gồm 2 mẫu giống Co-CM và Co-CNTP (Hình 1A). Nhìn trên sơ đồ có thể thấy mẫu Co-LB có khoảng cách di truyền xa nhất so với các mẫu còn lại, trong khi đó mẫu Co-TTT và Co-HBT nằm trên cùng một nhánh, thể hiện mối quan hệ di truyền gần nhất. Khi phân tích bằng chỉ thị ISSR, 12 mẫu giống đông trùng hạ thảo được chia thành 4 nhóm tại vị trí tương đồng di truyền trung bình. Cụ thể, nhóm I bao gồm 8 mẫu giống, nhóm II gồm duy nhất 1 mẫu giống là Co-HQV, nhóm III gồm 2 mẫu giống Co-LB và Co-CNTP và nhóm IV chỉ có 1 mẫu giống là Co-CM (Hình 1B). Về cơ bản, sơ đồ cho thấy mẫu Co-HQV và Co-CM có khoảng cách di truyền xa nhất trong khi đó Co-TTN, Co-TN thể hiện mối quan hệ di truyền gần nhất. Khi kết hợp chỉ thị RAPD và ISSR, sơ đồ mối quan hệ di truyền của 12 mẫu giống được thể hiện như sau: nhóm I gồm 7 mẫu giống, nhóm II gồm 3 mẫu giống và nhóm III gồm 2 mẫu giống. Trong mô hình kết hợp, sự phân nhóm di truyền của các cặp mẫu giống (Co-TTT và Co-HBT) và (Co-CM và Co-CNTP) khá tương đồng khi so sánh với mô hình phân tích bởi RAPD (Hình 1A, C). Sự phân nhóm tương tự cũng quan sát được ở cặp mẫu giống (Co-TTN và Co-TN) khi phân tích bởi chỉ thị ISSR và kết hợp RAPD + ISSR (Hình 1B, C).

Như vậy, khi phân tích bởi các chỉ thị RAPD hoặc ISSR riêng rẽ hay kết hợp hai chỉ thị RAPD + ISSR thì kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của 12 mẫu giống ĐTHT là có sự tương đồng cao. Sử dụng kiểm định Mantel để xác định mối tương quan giữa các ma trận tương đồng di truyền phân tích bởi các chỉ thị cho thấy có sự tương quan cao giữa các ma trận tương đồng di truyền. Hệ số tương quan (r) giữa hai ma trận phân tích bởi RAPD và ISSR là 0,741 (p-value <0,0001). Ma trận tương đồng di truyền phân tích bởi RAPD hay ISSR thể hiện mối tương quan rất cao với ma trận kết hợp giữa RAPD + ISSR, hệ số tương quan lần lượt là 0,934 và 0,932 (p-value <0,0001). Kết quả này đã khẳng định sự tương quan cao giữa các ma trận khi phân tích bởi các chỉ thị. Mặc dù vậy, sự đa dạng di truyền của các mẫu giống ĐTHT phân tích chỉ ra không tương quan với nguồn gốc thu thập của chúng. Các mẫu giống thu thập từ Hà Nội, Hưng Yên, Thái Nguyên, Đà Nẵng đều thuộc một nhóm di truyền trong khi thực tế đây là những địa phương có khoảng cách địa lý xa nhau. Lý giải cho điều này có thể là do các mẫu giống này đều là các mẫu nuôi cấy nhân tạo và được phân bố đi nhiều nơi. Kết quả tương tự cũng được ghi nhận bởi Sung & cs. (1999) và Wang & cs. (2008) khi phân tích các mẫu giống C. militaris bằng chỉ thị RAPD và ITS. Các nghiên cứu chỉ ra không có sự tương quan giữa đa dạng di truyền các mẫu giống C. militaris và nguồn gốc thu thập của chúng.

Khoa Công nghệ sinh học

Tài liệu tham khảo

Chen Y., Zhang Y.P., Yang Y., Yang D., (1999). Genetic diversity and taxonomic implication of Cordyceps sinensis as revealed by RAPD markers. Biochem Genet. 37(5-6):201-13.

Chen Y.Q., Hu B., Xu F., Zhang W.M., Zhou H., and Qu L.H. (2004). Genetic variation of Cordyceps sinensis, a fruit-body-producing entomopathogenic species from different geographical regions in China. FEMS Microbiology Letters 230: 153-158.

Dong J.Z., Lei C., Ai X.R., Wang Y., (2012). Selenium enrichment on Cordyceps militaris link and analysis on its main active components. Appl Biochem Biotechnol. 166(5):1215-24.

Holliday J., & Cleaver M., (2008). Medicinal Value of the Caterpillar Fungi Species of the Genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) - A Review. Int. J. Med. Mushrooms. Vol.10 (3): 219-234.

Holliday J.C, Cleaver P., Loomis-Powers M., & Patel D., (2004). Analysis of quality and techniques for hybridization of medicinal fungus Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. (Ascomycetes). Int. J. Med. Mushrooms. Vol. 6:151-164

Jędrejko K.J., Lazur J., Muszyńska B., (2021). Cordyceps militaris: An Overview of Its Chemical Constituents in Relation to Biological Activity. Foods. 10(11):2634.

Li S.P., Yang F.Q., Tsim K.W., (2006). Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine. J Pharm Biomed Anal. 41(5):1571-84.

Russell R., & Paterson M., (2008). Cordyceps – A traditional Chinese medicine and anotherfungal therapeutic biofactory?. Phytochem. 69: 1469–1495

Serrote C.M.L., Reiniger L.R.S., Silva K.B., Rabaiolli S.M.D.S., Stefanel C.M., (2020). Determining the Polymorphism Information Content of a molecular marker. Gene. 5:726:144175.

Sung J.M., Kim S.H., Yoon C.S., Sung G.H. & Kim Y.W., (1999). Analysis of genetic relationship of Cordyceps militaris in Korea by Random Amplified Polymorphic DNA. The Korean Journal of Mycology 27: 256-273 (In Korean).

Stone R., (2008). Mycology. Last stand for the body snatcher of the Himalayas? Science. 322(5905):1182.

Wang L., Zhang W.M., Hu B., Chen Y.Q., & Qu L.H., (2008). Genetic variation of Cordyceps militaris and its allies based on phylogenetic analysis of rDNA ITS sequence data. Fungal Diversity 31: 147-155.

Wu D.T., Lv G.P., Zheng J., Li Q., Ma S.C., Li A.P., Zhao J., (2016). Cordyceps collected from Bhutan, an appropriate alternative of Cordyceps sinensis. Sci. Rep. 6, 37668.