Chuối là loại trái cây xuất khẩu toàn cầu mang lại lợi ích kinh tế lớn khi đóng góp khoảng 50 tỷ USD mỗi năm cho các quốc gia trên thế giới. Tuy nhiên, loại cây này đang phải đối mặt với nguy cơ bị thiệt hại lớn về kinh tế do bệnh héo rũ gây ra bởi nấm Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Foc) - loại nấm có từ đất. Trong số các chủng Foc, chủng Foc tropical 4 (TR4) là chủng có độc tính cao nhất, khó tiêu diệt, kiểm soát và đặc biệt có thể lây nhiễm sang hầu hết các giống chuối khác. Hiện nay, việc kiểm soát bệnh héo rũ ở chuối Fusarium bằng các giống cây trồng có tính kháng chủng TR4 vẫn chưa có. Tuy nhiên, trong số các tác nhân kiểm soát sinh học để phòng trừ TR4, actinomycetes cho thấy tiềm năng đối kháng nhờ vào khả năng tổng hợp các hợp chất mang hoạt tính sinh học và kháng sinh.
Chi Streptomyces thuộc ngành Actinobacteria là một nguồn vật liệu tiềm năng khi tạo ra gần 75% hợp chất thứ cấp có tính kháng khuẩn. Ở đây, nhóm nghiên cứu đã thành công phân lập và sàng lọc xạ khuẩn Actinobacteria thông qua thu thập các mẫu đất ở độ sâu 10-15cm, pha loãng đất và đặt lên đĩa môi trường chứa chất ức chế nấm. Qua sàng lọc hoạt tính kháng nấm Foc TR4, 7 trong số 45 chủng xạ khuẩn được phân lập có hoạt tính kháng nấm mạnh (Hình 1a), trong đó chủng VNUA116 có tính kháng cao nhất với tỷ lệ ức chế sợi nấm là 65,00 ± 1,32% (Hình 1b,c) và thể hiện khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử (Hình 2). Khả năng tổng hợp các hợp chất kháng lại sự phát triển của sợi nấm và sự nảy mầm của chủng VNUA116 được chứng minh khi không bổ sung dịch lọc nuôi cấy chủng VNUA116, các bào tử Foc TR4 đều nảy mầm và phát triển thành sợi nấm dài trên lam kính sau 9h ủ ở nhiệt độ phòng (Hình 2e).
Hình 1. Phân lập và ảnh hưởng đối kháng của chủng VNUA116 đối với nấm bệnh Foc TR4, (a) sàng lọc hoạt tính kháng nấm của 45 chủng xạ khuẩn Actinobacteria với nấm bệnh Foc TR4, (b,c) sự phát triển sợi nấm của Foc TR4 trên đĩa đối chứng (cấy Foc TR4) và trên đĩa thí nghiệm (cấy Foc TR4 và chủng VNUA116), (d–e) sự khác biệt của sợi nấm Foc TR4 ở đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm với chủng VNUA116 (thước 10 μm)
Hình 2. Ảnh hưởng của dịch chiết thô chủng VNUA116 đến sự nảy mầm bào tử và đặc điểm hình thái của nấm bệnh Foc tr4 sau 9 giờ. (a, c) Hình thái bào tử trong đĩa đối chứng sau khi được xử lý bằng nước cất vô trùng, (b, d) Hình thái bào tử trong đĩa thí nghiệm có chứa dịch lọc nuôi cấy chủng VNUA116, (e) tỷ lệ nảy mầm bào tử ở đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm chứa dịch lọc nuôi cấy chủng VNUA116.
Ngoài ức chế sự phát triển của bào tử nấm bệnh Foc TR4, chủng VNUA116 còn thể hiện hoạt tính kháng nấm phổ rộng, chống lại 6 loại nấm gây bệnh khác. Phương pháp nuôi cấy đồng thời đã được sử dụng và cho thấy chủng VNUA116 ức chế sự phát triển sợi nấm của tất cả các loại nấm gây bệnh thử nghiệm (C. gloeosporioides, C. cassiicola, F. solani, S. rolfsii, Diaporthe sp., và F. oxysporum) với tỷ lệ giảm sinh sợi nấm dao động trong khoảng 59,46 đến 98,9% (Hình 3). Trong đó, chủng VNUA116 cho thấy tỷ lệ ức chế sinh trưởng sợi nấm Diaporthe sp cao nhất.
Hình 3. Hoạt tính kháng của chủng VNUA116 với một số loại nấm gây bệnh. 6 loại nấm gây bệnh được sử dụng trong thử nghiệm nuôi cấy kép bao gồm Colletotrichum gloeosporioides, Corynespora casiicola, Fusarium solani, Sclerotium rolfsii, Diaporthe sp. và Fusarium oxysporum.
Khi phân tích các đặc điểm hình thái, chủng VNUA166 phát triển tốt trên 6 môi trường ISP, phát hiện sắc tố hồng của khuẩn lạc (ISP1-5), sắc tố melanin (ISP6) và hình thái hai chiều không xoắn ốc, sự hình thành các nhánh ngắn từ sợi nấm chính (Hình 4g, Hình 1S) của VNUA116 qua phân tích SEM (kính hiển vi điện tử quét).
Hình 4. Đặc điểm nuôi cấy của chủng VNUA116 trên các môi trường ISP khác nhau, (a) dịch chiết nấm men tryptone —ISP1, (b) dịch chiết nấm men—agar chiết xuất từ mạch nha—ISP2, (c) agar từ bột yến mạch—ISP3, (d) muối vô cơ–tinh bột agar—ISP4, (e) glycerol–asparagine agar—ISP5 và (f) dịch chiết nấm men pepton – sắt agar– ISP6. (g) Quét kính hiển vi điện tử (SEM) cấu trúc bào tử của chủng VNUA116 ở độ phóng đại 3000×, thước 10 μm.
Đồng thời, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng VNUA116 (Bảng 1 và 2) có đặc tính của enzyme thủy phân như chitinase, cellulase, xylanase, protease, pectinase. Đặc biệt là khả năng hóa lỏng gelatin và sử dụng citrate, tạo ra H2S, IAA, siderophore và urease nhưng không tạo ra nitrate reductase. Chủng không tạo ra acetoin (MR, VP) hoặc indole; không sử dụng phốt phát và kali và có thể sử dụng tất cả 15 nguồn carbon và 8 nguồn nitơ đã được thử nghiệm (Bảng 2).
Bảng 1. Các đặc điểm sinh lý hóa của chủng VNUA116
Bảng 2. Đặc điểm sử dụng dinh dưỡng của chủng VNUA166
Phân tích trình tự gen 16S rRNA của chủng VNUA116 cũng cho thấy độ tương đồng cao (99.73%) của chủng VNUA116 và chi Streptomyces spp. Như vậy, đặc điểm hình thái, sinh hóa cũng như căn trình tự gen 16S rRNA đã xác định chủng VNUA116 là xạ khuẩn Streptomyces sp.VNUA116. Ngoài ra, các phản ứng khuếch đại PCR đã được thực hiện và phát hiện xạ khuẩn Streptomyces sp.VNUA116 chứa các đoạn gen sinh tổng hợp PKS-I and PKS-II.