1. Tổng quan về Lignin
Lignin là một loại polymer thơm tự nhiên, có thành phần phổ biến thứ hai sau cellulose. Lignin được tìm thấy trong thực vật, phụ phẩm nông nghiệp và nhiều nơi khác. Phân tử lignin không có tính đồng nhất, tạo liên kết với hemicellulose và bao quanh cellulose thông qua liên kết este trong thực vật để cung cấp độ cứng và bảo vệ thành tế bào. Lignin bao gồm các hợp chất phenol, trong đó chủ yếu có ba nhóm: guaiacyl (G), syringyl (S) và hydroxyphenyl (H), được polymer hóa thông qua liên kết ngang trung gian của phản ứng gốc enzyme, tạo ra β- liên kết O-4 chiếm ưu thế và các liên kết C-C và C-O khác (Ralph & cs., 2004). Do lignin là một phân tử lớn có cấu trúc rất phức tạp, việc ứng dụng, chuyển hóa lignin còn rất nhiều hạn chế. Vì vậy, sự phân hủy lignin của vi sinh vật đã nhận được sự quan tâm của các nhà khoa học để khắc phục các vấn đề khó khăn này.
Lignin có một cấu trúc chung là một vòng benzen với một đuôi gồm 3 carbon.
Hình 1. Cấu trúc phân tử Lignin
2. Hệ enzyme phân hủy lignin từ vi sinh vật
Sự phân hủy lignin của vi sinh vật được tiến hành bởi một lượng lớn các enzyme oxy hóa. Các enzyme chính để phân huỷ lignin được gọi là hệ enzyme lignolytic, bao gồm: phenol oxidase (laccase) và các peroxidase chứa heme (lignin peroxidase, mangan peroxidase, và peroxidase đa năng).
2.1. Laccase
Laccase là một chất oxy hóa đa nhân được tìm thấy trong thực vật, nấm và vi khuẩn. Theo nhiều kết quả nghiên cứu, laccase của nấm thường có khả năng khử cao hơn so với thực vật và vi khuẩn.
Laccase chứa 4 nguyên tử đồng (Cu) và 2 cầu liên kết disulfide phân bố trong 3 vùng khác nhau gọi là T1, T2 và T3. T1 là một trung tâm đơn nhân chứa 1 nhân Cu, trong khi một nhân Cu khác ở T2 và hai nhân Cu ở T3. Quá trình oxy hóa cơ chất xảy ra ở vùng T1 thông qua trình tự tripeptide His-Cys-His, sau đó các điện tử được chuyển đến trung tâm ba hạt nhân T2/T3 và diễn ra sự khử O2 thành nước (Mayolo-Deloisa & cs., 2020).
Hình 2. Cấu trúc của Laccase
Laccase tồn tại dưới dạng isoenzyme. Laccase oxy hóa các cơ chất tự nhiên bao gồm phenol, polyphenol, anilin, aryl diamine, phenol thay thế methoxy, hydroxyindol, benzenethiol, các hợp chất kim loại vô cơ, hữu cơ và nhiều loại khác. Do đó, laccase được ứng dụng nhiều như tẩy trắng bột giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải, chế biến thực phẩm, sử dụng trong tổng hợp chất hữu cơ, xử lý các nguồn nước thải bị ô nhiễm; xử lý phụ phẩm nông nghiệp để tạo nguyên liệu cho các quá trình khác.
2.2. Lignin peroxidase (LiP)
LiP là một glycoprotein, cấu trúc tinh thể được tạo thành từ các xoắn α, có 2 ion canxi và 4 liên kết disulfua để ổn định cấu trúc bậc ba. LiP gián tiếp phân hủy lignin thông qua việc oxy hóa rượu veratryl thành gốc cation khuếch tán tương ứng như một chất oxy hóa trực tiếp trên lignin. Vị trí hoạt động của LiP bao gồm một nguyên tử sắt chứa heme. Hai điện tử của enzyme sắt nguyên sinh bị H2O2 oxy hóa để tạo thành hợp chất thứ nhất, enzyme này nhận một điện tử để tạo thành hợp chất thứ hai. Cuối cùng, hợp chất thứ hai này được đưa trở lại trạng thái sắt nguyên sinh nghỉ bằng cách nhận thêm một điện tử từ chất khử (Francesca GM & cs., 2001).
Hình 3. Cơ chế hoạt động của Lignin peroxidase
LiP có thể phân hủy nhiều loại hợp chất phenolic và non-phenolic, do đó LiP là enzyme chính chịu trách nhiệm phân hủy lignin do khả năng khử cao của nó.
2.3. Mangan peroxidase (MnP)
MnP là một protein heme được glycosyl hóa và là peroxidase phân giải chất béo chính của basidiomycetes. Cấu trúc tinh thể của MnP bao gồm một ion Mn2+, một heme propionat và các chuỗi bên của Glu35, Glu39 và Asp179 . Quá trình phân giải lignin được xúc tác bởi MnP bao gồm cả bước oxy hóa và bước khử.
Hình 4. Cơ chế hoạt động của Mangan peroxidase
MnP liên kết H2O2 với enzyme sắt nguyên sinh, sau đó oxy hóa Mn2+ thành Mn3+ với sự có mặt của chất chelat, và Mn3+ được tạo ra sau đó chuyển đổi các hợp chất phenolic lignin thành các gốc phenoxyl. Các chất chelat hóa axit hữu cơ như oxalat và malonat có thể ổn định Mn3+ và kích thích hoạt động của enzyme. MnP có thể thúc đẩy sự phân hủy lignin và sản lượng metan, và 68.4% lignin từ chất thải rắn đô thị đã được loại bỏ bởi MnP (Jayasinghe PA & cs., 2011).
2.4. Peroxidase đa năng
Peroxidase đa năng là một enzyme phân giải lignin độc đáo được tìm thấy trong các chi nấm thối trắng Pleurotus và Bjerkandera. Peroxidase đa năng được gọi là peroxidase lai, thể hiện cơ chế xúc tác tương tự với cả LiP và MnP. Tuy nhiên, Peroxidase đa năng có thể phân hủy trực tiếp các chất nền có khả năng khử cao mà không có sự hiện diện của rượu veratryl và oxy hóa Mn2+ một cách độc lập, điều này khác với MnP và LiP (Camarero S., 1999).
2.5. β – Etherase
β – Etherase có thể phá vỡ liên kết β-aryl ether và biphenyl trong các phân tử lignin. Các β-etherase liên quan đến con đường dị hóa β-O-4 este và biphenyl để khử phân giải và chuyển đổi lignin. Liên kết este β-O-4 là liên kết phổ biến nhất và chiếm hơn 50% tất cả các liên kết este trong lignin, vì vậy sự phân hủy của nó là rất quan trọng đối với quá trình khử phân giải lignin (Reiter J & cs., 2013).
3. Một số vi sinh vật phân giải lignin
Lignin là chất có sẵn trong tự nhiên với khối lượng lớn; là nguyên liệu tuyệt vời để sản xuất các sản phẩm sinh học có giá trị gia tăng. Tuy nhiên lignin có tính không đồng nhất và khó bị phân hủy dẫn đến cản trở quá trình sử dụng và xử lý sinh học lignin hiệu quả. So với xử lý hóa học, xử lý sinh học với xúc tác vi sinh và enzyme là một phương pháp sạch và hiệu quả để khử và chuyển hóa lignin. Chính vì vậy, sau nhiều năm nghiên cứu và tìm hiểu, các nhà khoa học đã tìm ra được một số loài vi sinh vật có khả năng phân giải lignin.
3.1. Nấm mốc
Nấm mốc là những vi sinh vật phân giải lignin hiệu quả nhất, chúng có thể tiết ra nhiều loại enzyme phân giải lignin. Theo cơ chế phân huỷ lignin, nấm phân huỷ lignin chủ yếu bao gồm ba loại: nấm mục trắng, thối nâu và thối mềm. Trong số ba loại nấm phân huỷ lignin, chỉ có nấm mục trắng có thể phân huỷ hoàn toàn lignin thành CO2 và H2O (Blanchette RA, 1995).
Nấm mục trắng phân giải lignin bao gồm hầu hết các chủng nấm Basidiomycetes và một vài loài Ascomycetes. Trong số các loại nấm mục trắng, các loài Ceriporiopsis subvermispora, Phellinus pini, Ganoderma australe và Phlebia tremellosa đặc biệt phân hủy lignin và hemicellulose nhưng không phân hủy cellulose. Tuy nhiên, các chủng khác như Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Heterobasidionosystemsum và Irpex lacteusare có thể đồng thời phân hủy cả cellulose, hemicellulose và lignin. Các enzyme ngoại bào chính do nấm mục trắng tiết ra để phân hủy lignin là các oxidase và peroxidase. Các phản ứng oxy hóa được xúc tác bởi oxidoreductase để phân hủy lignin bao gồm sự phân cắt liên kết C-C và liên kết este, đồng thời loại bỏ chuỗi bên và vòng thơm (Zabel RA & cs., 2020).
Nấm thối nâu có thể thủy phân nhanh thành phần cellulose và hemicellulose trong khi chỉ oxy hóa một phần lignin. Nấm thối nâu được phát hiện phân hủy lignin thông qua các gốc hydroxyl được tạo ra thông qua oxy hóa Fenton (Bugg TD và cs, 2011). Các hydroquinon ngoại bào do nấm thối nâu tạo ra có thể khử Fe3+ của phức Fe-oxalat thành Fe2+, sau đó phản ứng với hydro peroxit (H2O2) để tạo ra các gốc hydroxyl.
Ngoài nấm thối nâu, nấm thối mềm cũng có thể phân hủy lignin bằng cách tấn công các đơn vị syringyl (Zabel RA và cs, 2020). Nấm thối mềm chủ yếu bao gồm Ascomycetes và Deuteromycetes và ưu tiên làm thoái hóa gỗ cứng. Trong khi người ta biết rất ít về các enzyme của nấm thối mềm liên quan đến việc phân hủy lignin, người ta cho rằng nấm thối mềm có thể biến đổi thay vì khoáng hóa lignin.
3.1. Xạ khuẩn
Mặc dù sự phân hủy lignin không diễn ra hoàn toàn như nấm, nhưng nhiều loài xạ khuẩn có khả năng chuyển hóa lignin thành các chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn theo 2 cách là hòa tan hoặc tạo ra một chất chuyển hóa có khối lượng phân tử lớn được gọi là polymer lignin có khả năng kết tủa với APPL. Các hợp chất này sẽ được phân hủy tiếp bởi các vi sinh vật khác. Streptomyces viridosporus T7A là xạ khuẩn đầu tiên được tìm thấy có khả năng sinh APPL đồng thời sinh ra heme peroxidase. Điều này chỉ ra rằng xạ khuẩn cũng có thể có một tập hợp các enzyme oxy hóa ngoại bào tham gia vào chuyển hóa lignin.
Các enzyme từ xạ khuẩn có thể tốt hơn các enzyme thu nhận từ nấm về khả năng chịu nhiệt và ít phụ thuộc vào các mediator. Chúng cũng có thể có lợi thế hơn trong việc phân hủy các lignin đã bị biến đổi và polymer hóa một phần trong dòng thải của quá trình nghiền và trong quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học (Bandounas & cs., 2011). Tuy nhiên, cho đến nay, tiềm năng phân hủy lignin của xạ khuẩn, đặc biệt là xạ khuẩn ưa nhiệt và chịu nhiệt vẫn còn chưa được nghiên cứu.
3.2. Vi khuẩn
Vi khuẩn có khả năng phân giải lignin đã được tìm thấy từ các môi trường sống khác nhau như đất, gỗ mục nát, nhà máy xử lý nước thải và ruột động vật. Mặc dù hiệu suất phân giải lignin của vi khuẩn kém hơn nấm, nhưng có khả năng thích ứng với môi trường mạnh hơn. Các nghiên cứu gần đây báo cáo rằng Actinobacteria, Proteobacteria và Firmicutes là những vi khuẩn phân hủy lignin chính (Bugg TD & cs., 2011). Vi khuẩn tiết ra các enzyme oxy hóa để phá vỡ lignin với sự hiện diện của oxy.
Lignin có thể bị phân hủy bởi điều kiện kỵ khí khắc nghiệt. Streptomyces và Rhodoccocus của Actinobacteria là những vi khuẩn điển hình cho sự phân hủy lignin trong điều kiện hiếu khí.
Vi khuẩn kỵ khí đã được xác định để chuyển đổi lignin và các chất thơm có nguồn gốc của nó thành metan và carbon dioxide. Hiệu suất phân hủy của lignin biến tính trong điều kiện kỵ khí tốt hơn lignin tự nhiên, có mức độ metoxyl hóa cao (Ahring BK. & cs, 2015). Tolumonas lignolytica BRL6-1 và Klebsiella sp. chủng BRL6-2 được phân lập và được đặc trưng là vi khuẩn phân hủy lignin kỵ khí, và một số enzyme giả định để phân hủy lignin đã được xác định (Woo HL, 2014; Billings AF & cs., 2015).
Với các enzyme và con đường trao đổi chất đặc biệt, vi khuẩn ưa nhiệt cho thấy khả năng phân hủy và biến đổi lignin. Vi khuẩn ưa Caldicellulosiruptor kronotskyensis có thể phân hủy rơm rạ tự nhiên mà không cần xử lý trước và tạo ra cacbohydrat hòa tan, axit hữu cơ và chất thơm có nguồn gốc lignin (Peng X. & cs., 2018).
Trịnh Thị Thu Thủy, Phan Thị Hiền, Phùng Thị Duyên
Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ahring, BK., Biswas, R., Ahamed, A., Teller, PJ., Uellendahl, H. (2015). Making lignin accessible for anaerobic digestion by wet-explosion pretreatment. Bioresour Technol. 175:182–8.
2. Bandounas, L., Wierckx, NJP., Winde, JH. de and Ruijssenaars, HJ. (2011) Isolation and characterization of novel bacterial strains exhibiting ligninolytic potential. BMC Biotechnol 11: 94-102.
3. Blanchette, RA. (1995). Degradation of the lignocellulose complex in wood. Can J Bot. 73:999.
4. Bugg, TD., Ahmad, M., Hardiman, EM., Rahmanpour, R. (2011). Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Nat Prod Rep. 28:1883–96.
5. Bugg, TD., Ahmad, M., Hardiman, EM., Singh, R. (2011) .The emerging role for bacteria in lignin degradation and bio-product formation. Curr Opin Biotechnol. 22:394–400.
6. Camarero, S. (1999). Description of a versatile peroxidase involved in the natural degradation of lignin that has both manganese peroxidase and lignin peroxidase substrate interaction sites. J Biol Chem. 274:10324–30.
7. Francesca, GM., Lanzalunga, O., Lapi, A., Piparo, MGL., Mancinelli, S. (2001). Isotope-effect profiles in the oxidative N-Demethylation of N,N-Dimethylanilines catalysed by lignin peroxidase and a chemical model. Eur J Org Chem. 2001:2305–10.
8. Jayasinghe, PA., Hettiaratchi, JP., Mehrotra, AK., Kumar, S. (2011). Effect of enzyme additions on methane production and lignin degradation of landfilled sample of municipal solid waste. Bioresour Technol. 102:4633–7.
9. Peng, X., Kelly, RM., Han, Y. (2018). Sequential processing with fermentative Caldicellulosiruptor kronotskyensis and chemolithoauto trophic Cupriavidus necator for converting rice straw and CO2 to polyhydroxybutyrate. Biotechnol Bioeng. 115:1624–9.
10. Ralph, J., Lundquist, K., Brunow, G., Lu,, F., Kim, H., Schatz, P.F. (2004). Lignins: natural polymers from oxidative coupling of 4-hydroxyphenyl-propanoids. Phytochem. Rev. 3, 29–60. doi: 10.1023/B:PHYT.0000047809.65444.a4.
11. Reiter, J., Strittmatter, H., Wiemann, LO., Schieder, D., Sieber, V. (2013). Enzymatic cleavage of lignin β-O-4 aryl ether bonds via net internal hydrogen transfer. Green Chem. 15:1373.
12. Zabel, RA., Morrell, JJ. (2020). Wood microbiology decay and its prevention. 2nd ed. Elsevier Inc.