Resveratrol là một phytoalexin được tổng hợp bởi một số loài thực vật để bảo vệ chúng chống lại các điều kiện bất lợi sinh học và phi sinh học (Gligorijević & cs., 2021). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng resveratrol có rất nhiều dược tính tốt như kháng oxy hóa, kháng viêm, tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa ung thư, bảo vệ tim mạch, chống lão hóa, giảm mỡ máu, trị chứng cao huyết áp (Khattar & cs., 2022). Do vậy, hoạt chất này có mặt trong nhiều các loại thuốc và thực phẩm tăng cường, bảo vệ sức khoẻ. Nhu cầu sử dụng và thương mại hóa hoạt chất resveratrol ngày càng tăng, trong khi hàm lượng resveratrol trong cây trồng tự nhiên lại rất thấp. Vì vậy, tăng năng suất thu nhận resveratrol từ các nguồn có sẵn là một giải pháp hiệu quả. Trong tự nhiên, resveratrol được tìm thấy nhiều trong vỏ quả nho đỏ, quả dâu tây, rễ cây lạc (đậu phộng), quả việt quất và một số loại hoa quả khác (Tian & cs., 2019). Mặc dù hàm lượng resveratrol trong rễ cây lạc khá thấp, chỉ 1,19 µg trong 1g chất tươi, so với 50,01 µg/g quả mâm xôi hay 24,06 µg/g vỏ quả nho (Khattar & cs., 2022), rễ cây lạc lại là nguồn nguyên liệu tiềm năng để thu nhận resveratrol do giá thành thấp và dồi dào.
Nuôi cấy rễ in vitro được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng, khắc phục được những hạn chế của phương pháp nuôi trồng truyền thống để thu nhận hoạt chất thứ cấp từ thực vật, do khả năng sản xuất ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn (Hussain & cs., 2022). Mặt khác, trong nuôi cấy rễ in vitro, việc bổ sung các chất kích hoạt (elicitor) giúp tăng đáng kể khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong quá trình nhân nhanh sinh khối rễ. Bên cạnh đó, nuôi cấy rễ in vitro còn giúp tối ưu hóa quá trình chiết xuất hoạt chất mục tiêu (Khanam & cs., 2022). Đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để cảm ứng tạo rễ tơ cây lạc, sau đó nhân nuôi tăng sinh khối rễ nhằm thu nhận hợp chất resveratrol (Park & cs., 2021). Tuy nhiên cho đến nay, chưa có công bố nào liên quan đến tạo và nhân nuôi rễ bất định cây lạc trong điều kiện in vitro. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm cảm ứng tạo rễ bất định cây lạc trong điều kiện in vitro và bước đầu khảo sát một số yếu tố đến sự sinh trưởng rễ bất định làm tiền đề cho việc thiết lập quy trình sản xuất các hợp chất thứ cấp phục vụ công nghiệp dược liệu ở Việt Nam.
Sự hình thành rễ bất định in vitro là quá trình được điều khiển bởi môi trường nuôi cấy và các yếu tố nội sinh như nhiệt độ, ánh sáng, chất kích thích sinh trưởng, đường, chất khoáng và các phân tử khác. Chất kích thích sinh trưởng auxin vừa có ảnh hưởng trực tiếp (tham gia vào quá trình phân chia và tăng trưởng tế bào), vừa có ảnh hưởng gián tiếp (tương tác với các chất kích thích và các phân tử khác) đến sự hình thành rễ bất định (Pop & cs., 2011). Bổ sung auxin vào môi trường nuôi cấy được chứng minh là có hiệu quả tích cực trong cảm ứng tạo rễ bất định nhiều loài thực vật như ở cây ba kích (Ninh Thị Thảo & cs., 2016), cây nhàu (Nguyễn Thị Ngọc Hương & Võ Thị Bạch Mai, 2009). Ba auxin α-NAA/IBA/IAA có tác dụng kích thích sự hình thành rễ bất định ở cây lạc với tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu biến động tuỳ thuộc vào loại auxin và nồng độ sử dụng. Cụ thể, ở công thức môi trường không bổ sung auxin, mô lá cây lạc hoàn toàn không tạo rễ. Trên môi trường bổ sung α-NAA, tỷ lệ mô lá cây tạo rễ bất định dao động 20-76,7%. Tỷ lệ mẫu tạo rễ tăng dần và đạt cao nhất ở công thức môi trường bổ sung 5 mg/l và 10 mg/l α-NAA, tương ứng đạt 70% và 76,7%. Đồng thời, số lượng rễ/mẫu cao nhất cũng ghi nhận được trên môi trường chứa 5 mg/l và 10 mg/l α-NAA, tương ứng đạt 4,1 và 3,6 rễ. Quan sát hình thái mẫu cho thấy, sau 5-7 ngày nuôi cấy, các mẫu lá có xu hướng cong lên trên bề mặt môi trường và sau 7-10 ngày, callus bắt đầu xuất hiện tại vị trí vết cắt với tỷ lệ mẫu tạo callus tăng tỷ lệ thuận với nồng độ α-NAA sử dụng và đạt cao nhất (90%) khi bổ sung 5-10 mg/ α -NAA vào môi trường nuôi cấy. Sau 15-20 ngày, rễ bắt đầu hình thành, các rễ có màu trắng hoặc vàng nâu, ăn sâu xuống môi trường và không phân nhánh (Hình 1). Tương tự như α-NAA, IAA và IBA cũng có tác dụng kích thích mẫu lá cây lạc tạo rễ bất định với tỷ lệ dao động từ 3,3-66,7% và số rễ/mẫu đạt dao động 0,2-2,6 rễ. Tỷ lệ mẫu tạo rễ tăng tỷ lệ thuận với nồng độ IAA/IBA và đạt cao nhất ở công thức bổ sung 10 mg/l IAA (66,7%) và 5-10 mg/l IBA (16,7-26,7%). Số rễ/mẫu trên các công thức môi trường bổ sung IAA/IBA ở nồng độ 2,5 mg/l là không có sự sai khác ở mức ý nghĩa P <5%. Trên môi trường bổ sung IBA, mẫu mô lá cây lạc hoàn toàn không tạo callus trong khi đó tỷ lệ mẫu tạo callus trên môi trường bổ sung IAA dao động từ 46,7-100% (Hình 1).
Hình 1. Sự hình thành rễ bất định từ mô lá cây lạc trên môi trường MS + 30 g/l đường + α-NAA/IBA/IAA sau 6 tuần nuôi cấy
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 3 auxin α -NAA, IBA và IAA đến khả năng tăng trưởng của rễ bất định cây lạc ở cho thấy cả ba auxin đều có ảnh hưởng tích cực. Trên môi trường đối chứng không bổ sung auxin, đoạn rễ bất định có kích thước 1,0 cm hoàn toàn không phân nhánh và không có sự phát triển (Hình 2). Ở các công thức bổ sung auxin, tỷ lệ rễ phân nhánh dao động từ 7,5-100% và số rễ nhánh/mẫu dao động từ 1,56-4,9 rễ tuỳ thuộc vào loại auxin và nồng độ sử dụng. Tỷ lệ rễ phân nhánh và số rễ nhánh/mẫu tăng tỷ lệ thuận với nồng độ auxin và đạt cao nhất khi bổ sung 1 mg/l với tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt tương ứng 100%, 60% và 20%; số rễ nhánh/mẫu đạt 4,9; 2,46 và 2,16 rễ sau 4 tuần nuôi cấy. Trên môi trường không bổ sung auxin các mẫu đoạn rễ bất định không sinh nhánh, rễ chuyển màu nâu đen và có xu hướng dừng phát triển sau khoảng 2 tuần nuôi cấy. Ngược lại, trên môi trường bổ sung auxin, rễ bất định cây lạc chuyển sang màu vàng, phân nhánh sau khoảng 10 ngày, rễ nhánh phát triển lan rộng và ăn sâu xuống môi trường. Trên môi trường có chứa auxin ở nồng độ cao (0,5-1,0 mg/l) nhiều rễ nhánh phát triển rễ phụ. Môi trường bổ sung IAA và IBA không quan sát thấy hiện tượng callus xuất hiện từ rễ lạc, tuy nhiên trên môi trường bổ sung α-NAA ở nồng độ 0,25 mg/l, callus xuất hiện đồng thời với sự xuất hiện rễ nhánh (Hình 2). Có thể thấy, bổ sung auxin vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực trong việc làm gia tăng tỷ lệ rễ phân nhánh cũng như số rễ nhánh, do vậy làm tăng sinh khối rễ bất định cây lạc. Trong 3 auxin khảo sát, α-NAA có ảnh hưởng mạnh mẽ hơn IAA và IBA đến sự tăng trưởng rễ bất định cây lạc với nồng độ tối ưu là 1 mg/l.
Hình 2. Rễ bất định cây lạc trên môi trường MS bổ sung auxin sau 6 tuần nuôi cấy
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Gligorijević N., Stanić-Vučinić D., Radomirović M., Stojadinović M., Khulal U., Nedić O. & Ćirković Veličković T. (2021). Role of resveratrol in prevention and control of cardiovascular disorders and cardiovascular complications related to COVID-19 disease: Mode of action and approaches explored to increase its bioavailability. Molecules. 26: 2834.
2. Hussain M.J., Abbas Y., Nazli N., Fatima S., Drouet S., Hano C. & Abbasi B.H. (2022). Root cultures, a boon for the production of valuable compounds: A comparative review. Plants. 11: 439.
3. Khanam M.N., Anis M., Javed S.B., Mottaghipisheh J. & Csupor D. (2022). Adventitious root culture an alternative strategy for secondary metabolite production: A review. Agronomy. 12: 1178.
4. Khattar S., Khan S.A., Zaidi S.A.A., Darvishikolour M., Farooq U., Naseef P.P., Kurunian M.S., Khan M.Z., Shamim A., Khan M.M.U., Iqbal Z. & Mirza M.A. (2022). Resveratrol from dietary supplement to a drug candidate: An assessment of potential. Pharmaceuticals.15(8): 957.
5. Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thùy Linh, Nguyễn Tuấn Minh, Nguyễn Quỳnh Chi & Trần Thị Anh Đào (2016). Nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ bất định cây Ba kích (Morinda officinalis How). Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 14(6): 921-930.
6. Nguyễn Thị Ngọc Hương & Võ Thị Bạch Mai (2009). Tìm hiểu sự phát sinh hình thái rễ trong nuôi cấy in vitro cây nhàu (Morinda citrifolia L.). Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ. 12(17): 100-105.
7. Park Y.-E., Park C.-H., Yeo H.-J., Chung Y.-S. & Park S.-U. (2021). Resveratrol biosynthesis in hairy root cultures of tan and purple seed coat peanuts. Agronomy. 11: 975.
8. Pop T.I., Pamfil D. & Bellini C. (2011). Auxin control in the formation of adventitious roots. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca. 39(1): 307-316.
9. Tian L., Zeng Y., Zheng X. & Liu T. (2019). Detection of peanut oil adulteration mixed with rapeseed oil using gas chromatography and gas chromatography-ion mobility spectrometry. Food Analytical Methods. 12(9).
Ninh Thị Thảo – Bộ môn CNSH Thực vật – Khoa CNSH
Liên hệ: ntthao@vnua.edu.vn